Cultivo de bacterias: métodos, principios, pasos y condiciones

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. Última modificación: 2023-12-17 05:23

Los microorganismos en la naturaleza que nos rodea están en todas partes: en los suelos, cuerpos de agua, en las superficies de varios objetos, las personas y los animales están habitados por ellos. Todo esto puede servir como fuente de contaminación microbiana de alimentos, medicamentos y líneas de producción. El cultivo de bacterias es necesario para estudiar sus propiedades, necesidades y características. Esto, a su vez, es un paso importante en el desarrollo de varios medicamentos, el diagnóstico de laboratorio de enfermedades, el cálculo de reactores de producción y mucho más.

Conceptos generales

Cultivo de bacterias en microbiología se refiere al cultivo de microorganismos llevado a cabo en el laboratorio. A su vez, los microbios que han crecido en un medio nutritivo seleccionado se denominan cultivo. Los cultivos pueden ser mixtos si están formados por diferentes tipos de microorganismos, y puros si están representados por un solo tipo de bacteria.

Si es nutricionalEn el medio se coloca una sola célula, y como resultado de su reproducción se obtiene un grupo de individuos, entonces a este conjunto de microorganismos se le llama clon. Cuando un clon se desarrolla hasta el punto en que se vuelve visible a simple vista, esta colección de bacterias se denomina colonia.

Por lo general, el cultivo de bacterias aisladas de diferentes fuentes se lleva a cabo por separado. Cada uno de estos grupos de microbios cultivados por separado se denomina cepa. Entonces, si un tipo de estafilococo se aísla de tres fuentes (o diferentes porciones del mismo producto, diferentes personas), hablan de tres cepas de este tipo de estafilococo.

Factores de crecimiento bacteriano

Estos incluyen varios aminoácidos, lípidos, bases de purina y otros compuestos necesarios para el desarrollo de microorganismos. Algunos microbios pueden producir de forma independiente las sustancias que necesitan, mientras que otros necesitan recibirlas en su forma final. De acuerdo con las necesidades de los microorganismos en ciertos factores de crecimiento, se lleva a cabo la identificación y diferenciación de bacterias. Además, este parámetro es importante para la correcta preparación de un medio nutritivo para trabajos de laboratorio y biotecnológicos:

Aminoácidos. Las bacterias pueden requerir un aminoácido o grupo de ácidos en particular. Entonces, los clostridios necesitan leucina y tirosina, los estreptococos necesitan leucina y arginina. Los microorganismos que requieren aminoácidos del exterior para crecer se denominan auxótrofos.
Bases púricas y pirimidínicas, así como sus derivados (adenina, guanina y otros). Son un factor importante en el crecimiento de muchosEspecies de estreptococos.
Vitaminas. Forman parte de las coenzimas requeridas por las bacterias. Por lo tanto, el ácido nicotínico, así como su amida, que son parte de NAD y NADP, son necesarios para la difteria y la shigella corynebacteria. La tiamina, como parte integral del pirofosfato, es requerida por Staphylococcus aureus, neumococo, brucella. El ácido pantoténico, que es parte de la coenzima CoA, es requerido por el bacilo del tétanos y ciertos tipos de estreptococos. Los citocromos, y por lo tanto el ácido fólico, los hemo y la biotina que los forman, son necesarios para Mycobacterium tuberculosis y Haemophilus influenzae.

Requisitos ambientales

Condiciones de los medios de cultivo para el cultivo de bacterias:

Nutrición. Deben contener sustancias, además, en forma fácilmente digerible, necesarias para que los microorganismos se alimenten y repongan energía. Estos incluyen organógenos y minerales. Algunos microorganismos requieren además vitaminas y aminoácidos que no pueden sintetizar.
Nivel de pH óptimo. Afecta la permeabilidad de la membrana celular y, en consecuencia, la capacidad de absorción de nutrientes por parte de la bacteria. La mayoría de las veces, el valor del pH debe estar en el nivel de 7, 2–7, 4. Muchos microorganismos en el curso de su vida producen productos con reacciones ácidas o alcalinas, y para que el pH del medio nutritivo no cambie, debe almacenarse en búfer.
Isotónica. La presión osmótica en el medio nutritivo para el cultivo de bacterias debe tener los mismos valores quedentro de las células microbianas. Suele corresponder a una solución de NaCl al 0,5 %.
Esterilidad. Esto se debe a que la aparición de bacterias extrañas distorsionará los resultados del estudio de la cepa analizada.
Nivel de humedad. Este indicador, junto con la consistencia del medio, debe tener características óptimas para un tipo particular de bacteria.
Potencial redox (RH2). Muestra la proporción de sustancias que donan y aceptan electrones, así como el nivel de saturación de oxígeno del medio nutritivo. Para aerobios y anaerobios, las condiciones para cultivar bacterias difieren algo en este indicador. Los microorganismos anaeróbicos se reproducen mejor con valores de RH2 por debajo de 5 y los microorganismos aeróbicos al menos 10.
Uniformidad. Es importante que el medio de cultivo contenga cantidades constantes de sus ingredientes individuales. Además, se prefieren las soluciones transparentes, que facilitan el seguimiento del crecimiento de los cultivos o el aviso de contaminación.

Tipos de medios de cultivo

La elección de un medio particular para el cultivo de microorganismos está influenciada por muchos factores, entre los que se encuentran las características de su nutrición y el propósito del estudio. Las principales características que subyacen a la clasificación de los medios nutrientes son:

1. Componentes. Según las sustancias iniciales utilizadas para crear el sustrato, se distinguen:

naturales, que se preparan a partir de productos de origen animal o vegetal (por ejemplo, carne, leche, fruta) y son aptos para el cultivo mixtocultivos;
semisintéticos, en los que los costosos productos alimenticios naturales se reemplazan por productos no alimenticios (por ejemplo, harina de huesos, coágulos de sangre), y que son óptimos para cultivar ciertos tipos de bacterias o aislar sus productos metabólicos del entorno;
sintéticos, que se preparan a partir de cantidades precisas de compuestos químicos, tienen una composición constante conocida y son fácilmente reproducibles.

2. Consistencia (densidad). Distinguir ambientes:

líquido;
denso;
semilíquido.

Los dos últimos se preparan a partir de soluciones especiales o sustancias líquidas con la adición de agar-agar o gelatina para crear la densidad requerida. Además, un entorno denso para el crecimiento de bacterias es el suero sanguíneo coagulado, las patatas, los medios de gel de sílice, la carragenina.

3. Compuesto. Sobre esta base, los entornos son:

simple, cuya lista es corta: caldo de peptona de carne (MBB), caldo Hottinger y agar, agar de peptona de carne (MPA), gelatina nutritiva y agua de peptona.
complejo, preparado a partir de simples con la adición de sangre, suero, carbohidratos y otras sustancias.

4. Cita. Se distinguen los siguientes medios nutrientes:

main se utilizan para cultivar muchos microbios patógenos (generalmente de composición simple);
los especiales se utilizan para aislar y cultivar bacterias que no crecen en sustratos simples;

Los

selectivos (también son selectivos) son adecuados para aislar un tipo específico de bacterias e inhibir el crecimiento de los microbios asociados (selectividadcreado agregando ciertas sustancias a los medios, como antibióticos o sales, o ajustando el pH);
el diagnóstico diferencial permite distinguir un tipo de bacteria de otro evaluando la actividad enzimática, por ejemplo, del medio;
se necesitan conservantes para la inoculación inicial con el posterior transporte de las muestras, ya que previenen la muerte de los microorganismos e inhiben el crecimiento de otras bacterias.

Preparación de medios

El paso más importante en el cultivo de bacterias anaerobias es la preparación de un medio nutritivo adecuado. Después de seleccionar los parámetros óptimos, continúe con las siguientes etapas:

pesaje, seleccionando una muestra de componentes en una balanza analítica;
disolución realizada en agua destilada calentada a 70 °C, y los fosfatos, microsales y macrosales se disuelven por separado;
hervir al baño maría durante dos minutos;
Determinación del pH mediante papel indicador o potenciómetro;
filtración a través de filtros de papel o tela húmeda para medios líquidos y densos fundidos, y a través de un filtro de gasa de algodón para medios de agar;
embotellado realizado a 3/4 de capacidad;
esterilización dependiente del medio;
el control de la esterilidad se lleva a cabo mediante la sedimentación durante dos días en un termostato, seguido de la visualización;
control químico para establecer el pH y contenido de los necesariosartículos;
control biológico por inoculación de prueba.

Esterilización de cristalería y medios

Uno de los principios básicos del cultivo bacteriano es la esterilidad. El crecimiento y desarrollo de microorganismos extraños puede afectar las características del medio nutritivo cambiando su composición química y pH. La esterilización es la principal condición para el cultivo de cultivos puros. En la práctica, este término significa los métodos de destrucción de absolutamente todas las formas de vida en la superficie y en el volumen de los objetos esterilizados. Los recipientes, los instrumentos utilizados, los medios y otros elementos utilizados durante el estudio se esterilizan.

Algunos tipos de esterilización:

Encendido. La esterilización de asas y agujas para siembra, portaobjetos de vidrio y algunos instrumentos se puede realizar con un mechero o una lámpara de alcohol.
Ebullición. Adecuado para manipular jeringas, agujas, alimentos, pero no mata las esporas bacterianas.
Esterilización por calor seco. Se lleva a cabo en un armario de secado especial y es adecuado para procesar matraces, tubos de ensayo y otros artículos de vidrio de laboratorio.
Esterilización a vapor. Realizado en autoclave, este método es muy eficaz. Pero no es adecuado para medios nutrientes que contengan proteínas o cualquier otro compuesto que se descomponga a altas temperaturas. Más ahorro se puede llamar tyndalization. Se lleva a cabo en la Caldera Koch y combina la germinación de esporas con su destrucción.
Pasteurización. Se utiliza para medios que cambian sus propiedades cuando se hierven (por ejemplo, leche, vino, cerveza), capaces delibrarlos de microorganismos no portadores de esporas. La temperatura de procesamiento es de solo 50-60 ° C durante quince a treinta minutos. En algunos casos se utiliza la esterilización en frío, realizada mediante filtros o rayos UV.

Condiciones de cultivo de bacterias

El crecimiento y desarrollo de bacterias es posible solo bajo ciertos factores y los valores de cada uno de ellos:

1. Temperatura. Hay tres grupos de bacterias que difieren en las preferencias de temperatura:

termófilos, o microbios amantes del calor, crecen a 45-90 °C, lo que significa que no se multiplican en organismos humanos y animales;
los psicrófilos, o microorganismos amantes del frío, prefieren temperaturas en el rango de 5 a 15 °C y se cultivan en cámaras frigoríficas;
mesófilos, se desarrollan a una temperatura de 25-37 °C, incluyen la mayor parte de las bacterias.

2. Luz. Es una característica del cultivo de bacterias fototróficas, ya que realizan el proceso fotosintético. Pero para la mayoría de los microbios, la iluminación no es un requisito previo. E incluso viceversa, la radiación ultravioleta solar puede suprimir su desarrollo.

3. Agua. Todos los microorganismos necesitan agua en forma accesible (líquida). Es por eso que los alimentos congelados tienen poco o ningún crecimiento de bacterias.

4. Acidez del ambiente. Este principio de cultivo de bacterias ya se ha discutido en detalle anteriormente.

5. Aireación. El oxígeno, como elemento químico, es parte integrante del agua y de un número considerable de compuestos utilizados paracultivo de microorganismos. El oxígeno gaseoso también puede estar contenido en agua y otros líquidos en forma disuelta. Una parte importante de las bacterias necesita un suministro constante de moléculas de oxígeno. Pero para una serie de microorganismos, es innecesario o, peor aún, el oxígeno gaseoso es tóxico para ellos, ya que no tienen catalasa y peroxidasa, que destruyen los productos respiratorios tóxicos. Por lo tanto, el paso más importante en el cultivo de bacterias anaerobias es la eliminación de las moléculas O₂ del medio nutritivo.

6. Cultivo de microorganismos. El cultivo de bacterias aeróbicas y anaeróbicas se lleva a cabo en diferentes capas del medio ambiente y en diferentes modos.

Cultivo de microorganismos aeróbicos

El cultivo de bacterias aeróbicas requiere oxígeno molecular. Para obtener cultivos puros de aerobios que puedan ser utilizados con éxito en medicina y en la industria alimentaria, se utilizan los siguientes métodos:

cultivo superficial en medios densos o en medios líquidos (su capa delgada) cuando el oxígeno proviene directamente del aire;
cultivo profundo en medios líquidos, cuando mediante una aireación constante se consigue un aumento de la cantidad de oxígeno disuelto en ellos.

Cultivo de microorganismos anaeróbicos

El principio básico del cultivo de bacterias de este tipo es su mínimo contacto con el oxígeno atmosférico. Proporcionar condiciones para su crecimiento es mucho más difícil que para los aerobios. Los siguientes métodos se utilizan para aislar anaerobios de moléculas O₂:

Físico. Este método de cultivo de bacterias anaerobias se reduce a su cultivo en un aparato de vacío especial: un microanaerostato. El aire que contiene se reemplaza por una mezcla de gas especial de nitrógeno con la adición de un 10 % de hidrógeno y un 5 % de dióxido de carbono.
Químico. Estos incluyen: uso de agentes absorbentes (por ejemplo, Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) o agentes reductores (como el ácido ascórbico).
Biológico. Se trata del cocultivo de aerobios y anaerobios en un sistema cerrado. Este método de cultivo de bacterias consiste en sembrar la mitad de una placa de Petri con algunas de las especies de bacterias aerobias y la otra mitad con las anaerobias estudiadas. Su desarrollo comenzará en el momento en que se agote todo el oxígeno.

Los siguientes métodos de siembra son adecuados para cultivar bacterias anaerobias:

en la capa superficial;
en la capa superficial llena de parafina estéril;
en medio de un medio nutritivo denso;
en capas profundas de medios viscosos.

Obtención de cultivo puro

Los microbiólogos suelen trabajar con muestras habitadas por muchos tipos diferentes de microbios. Sin embargo, para determinar la posición sistemática de los microorganismos (familia, género, especie), así como para estudiar sus características, es necesario aislarlos y desarrollar un cultivo puro. Son de gran importancia en muchas industrias alimentarias, por ejemplo, queso, pan, kvas, vino, etc. El cultivo de bacterias ácido lácticas permite obtenerun componente esencial para la producción de productos lácteos fermentados, masa, cacao, ensilado e incluso plástico.

El método de aislamiento de un cultivo puro en medio denso se basa en la separación mecánica de células de microorganismos con su posterior cultivo aislado. La muestra se transfiere a un volumen estéril de agua o solución salina (volumen 10-100 ml) y luego se agita durante dos minutos. Para la extracción de microorganismos localizados en el espesor del material en estudio (por ejemplo, embutidos o queso), primero se realiza el frotamiento de las piezas de muestra con instrumentos estériles con arena. El material que se ha sometido a una preparación preliminar, que pesa 1 go un volumen de 1 ml, se diluye con agua estéril por 10, 100, 1000, etc. veces. Se elige el grado de dilución que da una concentración de células correspondiente a las capacidades del método.

El posterior cultivo de microorganismos consiste en preparar un medio nutritivo. Por lo general, se elige un medio denso (MPA). Primero se derrite y se enfría a 45-50 °C, y solo luego se vierte en varias placas de Petri (de tres a cinco piezas), en el fondo de las cuales se colocan hisopos de la sustancia de prueba de varias concentraciones. A continuación, se lleva a cabo la mezcla del medio nutritivo aún no congelado y el material introducido en él. Así se fijan las células en varios puntos del volumen del sustrato.

A continuación, las placas de Petri se colocan en un termostato durante 2 días a 22 °C. Durante este tiempo, las células se multiplican hasta tal punto que la colonia formada por cada una de las células se vuelve visible a simple vista. Cada uno de ellos es un cultivo puro del tipo de bacterias de cuyas células serosa.

Después de eso, de las placas de Petri, los microorganismos se subcultivan en tubos de ensayo separados llenos de un medio nutritivo. De esta forma, los cultivos puros se aíslan de una muestra mixta. Este método lleva el nombre de su desarrollador: R. Koch. También se le llama comúnmente el método de copa, o siembra agotadora. Después de obtener cultivos puros de varios tipos de bacterias, se determina su forma, esporas y familias.

Todo el trabajo debe realizarse de acuerdo con los principios de asepsia. Para evitar el desarrollo prematuro de microorganismos, el estudio debe realizarse inmediatamente después del muestreo. El agua del grifo se analiza después de vaciar las primeras porciones, ya que pueden contener microbios acumulados en tuberías y grifos. La microflora de frutas, bayas y verduras se encuentra principalmente en la superficie (cáscara), por lo tanto, se realizan lavados a partir de ella. Para ello, coloque el feto en un recipiente estéril y llénelo con la cantidad de agua necesaria. Luego se agitan con bastante fuerza y se vierte el agua en otro recipiente. Los cultivos de productos de tela también se obtienen en hisopos, pero previamente se cortan trozos de un tamaño determinado.