La tinción de Gram se usa ampliamente en microbiología, ya que es una de las formas más fáciles de diferenciar bacterias según la composición de su pared celular. Según Gram, todas las bacterias se pueden dividir en grampositivas (Gram (+)) y gramnegativas (Gram (-)). El método de tinción de Gram se desarrolló en 1884 y no ha perdido popularidad desde entonces, aunque se ha modificado varias veces.
Estructura de la pared celular
La tinción de Gram revela si una bacteria es Gram-positiva o Gram-negativa. La división de las bacterias en Gram (+) y Gram (-) se realiza de acuerdo con la estructura de su pared celular.
La pared celular contiene la mayor cantidad de peptidoglicano (mureína), una sustancia compleja que incluye peptapéptido y glicano. El glucano consta de residuos alternados de N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico unidos entre sí por β-1,4-enlaces glucosídicos. El peptidoglucano proporciona mantenimiento de la forma celular, protección osmótica y funciones antigénicas.
Principales diferencias entre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
Diferentes bacterias tienen diferentes espesores de capa de peptidoglicano. En las bacterias que se clasifican como grampositivas varía de 15 a 80 nm, mientras que en las gramnegativas es de 2 a 8 nm. Al mismo tiempo, las bacterias Gram-negativas tienen una estructura especial debajo de la capa de peptidoglicano, que las bacterias Gram-positivas no tienen: el espacio periplásmico. Este espacio está lleno de enzimas hidrolíticas: β-lactamasa, ribonucleasa 1, fosfatasa. Son estas enzimas las responsables de la resistencia de las bacterias Gram-negativas a muchos antibióticos.
La capa de Gram(-) peptidoglicano de las bacterias está unida al lipopolisacárido, una estructura antigénica que contiene endotoxina. En las bacterias Gram(+), los ácidos teicoicos realizan funciones similares.
Las bacterias gramnegativas tienen una estructura adicional: la membrana externa.
La esencia del método de tinción
Antes de comenzar a teñir, se preparan frotis de las bacterias estudiadas. Para ello, se gotea agua sobre un portaobjetos de vidrio y allí se añade un cultivo de microorganismos con un asa bacteriana. Luego, después de que el agua se haya secado por completo, se fija la mancha: el portaobjetos de vidrio se lleva varias veces sobre la llama del quemador. La tinción de Gram es más eficaz que la tinción de bacterias vivas: las moléculas de colorante se unen mejor a las células muertas.
La coloración se realiza en varias etapas:
- Se colocan pequeños trozos de papel de filtro en un frotis fijo y se vierte el colorante principal: violeta de genciana o azul de metileno.
- Después de 3-5 minutos, retire el papel de filtro coloreado y llene el frotis con solución de Lugol durante 1 minuto. En este caso, la preparación se oscurece.
- Se escurre la solución de Lugol y se trata el frotis con alcohol etílico puro: se gotean unas gotas sobre la preparación, se escurre después de 20 segundos. El procedimiento se repite 2-3 veces.
- Enjuague el portaobjetos de prueba con agua destilada.
- Producir tinción adicional - terminar la preparación con fucsina. Después de 1-2 minutos, el tinte se lava.
- Después de que el agua se seque, examine el frotis bajo un microscopio. Las bacterias grampositivas serán azul-violeta, las bacterias gramnegativas serán rosadas o rojas.
Causas de los diferentes patrones de tinción
Como se describió anteriormente, la tinción de Gram de las bacterias tiñe las bacterias Gram-positivas de azul violeta, mientras que las bacterias Gram-negativas se tiñen de rojo o rosa. La razón de la tinción diferencial de bacterias por este método es que después de que la forma soluble de violeta de genciana ingresa a la célula, el tinte pasa a la forma de yodo insoluble. Durante el tratamiento de bacterias con alcohol etílico, los lípidos se extraen de la membrana bajo la acción de este disolvente no polar. La membrana entonces se vuelve porosa y deja de ser una barrera importante para la lixiviación del tinte. Sin embargoEl peptidoglicano es más resistente a los disolventes no polares, incluido el alcohol. Es él quien evita que el tinte se elimine por lavado, por lo que las bacterias con una capa gruesa de mureína se vuelven azul-violeta (grampositivas) y después del tratamiento con alcohol no cambian de color.
La fina capa de mureína de las bacterias gramnegativas no puede retener las moléculas de colorante en la célula, por lo que después de la acción del alcohol se vuelven incoloras - tiñen a las gramnegativas.
Después de la exposición de un frotis a la fucsina, las bacterias teñidas con Gram permanecen azul-violeta, mientras que las bacterias Gram-negativas se vuelven rosa-rojas.
Ejemplos de bacterias Gram(+) y Gram(-)
Las bacterias gramnegativas incluyen cianobacterias, bacterias del azufre, bacterias del hierro, clamidia, rickettsia, bacterias acéticas, muchas metilobacterias, bacterias tiónicas, arsenitobacterias y carboxibacterias.
Las bifidobacterias, muchas bacterias acuáticas, los estreptococos y los estafilococos son grampositivos.
