Los métodos de investigación de biología molecular desempeñan un papel importante en la medicina moderna, la ciencia forense y la biología. Gracias a los avances en el estudio del ADN y ARN, una persona es capaz de estudiar el genoma de un organismo, determinar el agente causal de una enfermedad, reconocer el ácido nucleico deseado en una mezcla de ácidos, etc.
Métodos de investigación en biología molecular. ¿Qué es?
En los años 70 y 80, los científicos lograron por primera vez descifrar el genoma humano. Este evento dio impulso al desarrollo de la ingeniería genética y la biología molecular. El estudio de las propiedades del ADN y el ARN ha llevado al hecho de que ahora es posible utilizar estos ácidos nucleicos para diagnosticar una enfermedad, estudiar genes.
Obtención de ADN y ARN
Los métodos de diagnóstico de biología molecular requieren la presencia de material de partida: más a menudo se trata de ácidos nucleicos. Hay varias formas de aislar estas sustancias de las células de los organismos vivos. Cada uno de ellos tiene sus propias ventajas y desventajas, y es necesariotener en cuenta al elegir un método para aislar ácidos nucleicos puros.
1. Obtención de ADN según Marmur. El método consiste en tratar una mezcla de sustancias con alcohol, como resultado de lo cual precipita ADN puro. La desventaja de este método es el uso de sustancias agresivas: fenol y cloroformo.
2. Aislamiento de ADN según Boom. La principal sustancia utilizada aquí es el tiocianato de guanidina (GuSCN). Contribuye a la precipitación del ácido desoxirribonucleico sobre sustratos especializados, de los que posteriormente se puede recoger mediante un tampón especial. Sin embargo, GuSCN es un inhibidor de PTC, e incluso una pequeña parte del mismo que ingresa al ADN precipitado puede afectar el curso de la reacción en cadena de la polimerasa, que desempeña un papel importante en el trabajo con ácidos nucleicos.
3. Sedimentación de impurezas. El método se diferencia de los anteriores en que no son las moléculas de ácido desoxirribonucleico las que precipitan, sino las impurezas. Para hacer esto, se utilizan intercambiadores de iones. La desventaja es que no todas las sustancias pueden precipitar.
4. Detección masiva. Este método se utiliza en los casos en que no se necesita información exacta sobre la composición de la molécula de ADN, pero sí para obtener algunos datos estadísticos. Esto se explica por el hecho de que la estructura del ácido nucleico puede dañarse cuando se trata con detergentes, en particular álcalis.
Clasificación de métodos de investigación
Todos los métodos de investigación en biología molecular se dividen en tres grandes grupos:
1. Amplificación (usando muchas enzimas). Aquíse refiere a PCR - reacción en cadena de la polimerasa, que juega un papel importante en muchos de los métodos de diagnóstico.
2. No amplificador. Este grupo de métodos está directamente relacionado con la operación de mezclas de ácidos nucleicos. Ejemplos son 3 blots, hibridación in situ, etc.
3. Métodos basados en el reconocimiento de una señal de una molécula sonda que se une a una sonda específica de ADN o ARN. Un ejemplo es el sistema de captura Hybride (hc2).
Enzimas que se pueden utilizar en métodos de investigación de biología molecular
Muchos métodos de diagnóstico molecular implican el uso de una amplia gama de enzimas. A continuación se muestran los más utilizados:
1. Enzima de restricción - "corta" la molécula de ADN en las partes necesarias.
2. ADN polimerasa: sintetiza una molécula de doble cadena de ácido desoxirribonucleico.
3. Transcriptasa inversa (revertasa): se utiliza para sintetizar ADN en una plantilla de ARN.
4. ADN ligasa: responsable de la formación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos.
5. Exonucleasa: elimina los nucleótidos de las secciones terminales de la molécula de ácido desoxirribonucleico.
PCR es el principal método de amplificación de ADN
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se usa activamente en la biología molecular moderna. Este es un método en el que se puede obtener una gran cantidad de copias de una sola molécula de ADN (las moléculas se amplifican).
Funciones principales de PCR:
- diagnósticoenfermedades;
- clonación de segmentos de ADN, genes.
Los siguientes elementos son necesarios para llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa: la molécula de ADN inicial, una ADN polimerasa termoestable (Taq o Pfu), fosfatos de desoxirribonucleótidos (fuentes de bases nitrogenadas), cebadores (2 cebadores por 1 molécula de ADN) y el propio sistema tampón, en el que todas las reacciones son posibles.
PCR consta de tres pasos: desnaturalización, recocido del cebador y elongación.
1. Desnaturalización. A una temperatura de 94-95 grados centígrados, los enlaces de hidrógeno entre las dos hebras de ADN se rompen y, como resultado, obtenemos dos moléculas monocatenarias.
2. Primer recocido. A una temperatura de 50 a 60 grados centígrados, los cebadores se unen a los extremos de las moléculas de ácido nucleico monocatenario por el tipo de complementariedad.
3. Alargamiento. A una temperatura de 72 grados, se produce la síntesis de moléculas hijas de doble cadena de ácido desoxirribonucleico.
Secuenciación de ADN
Los métodos de investigación en biología molecular a menudo requieren el conocimiento de la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido desoxirribonucleico. La secuenciación se lleva a cabo para determinar el código genético. El diagnóstico molecular del futuro se basará en el conocimiento obtenido de la secuenciación humana.
Se distinguen los siguientes tipos de secuenciación:
- Secuenciación de Maxam-Gilbert;
- Secuenciación de Sanger;
- pirosecuenciación;
- nanoporosecuenciación.
