El concepto de enzimas inmovilizadas apareció por primera vez en la segunda mitad del siglo XX. Mientras tanto, allá por 1916, se descubrió que la sacarosa absorbida en carbono retenía su actividad catalítica. En 1953, D. Schleit y N. Grubhofer llevaron a cabo la primera unión de pepsina, amilasa, carboxipeptidasa y RNasa con un transportador insoluble. El concepto de enzimas inmovilizadas se legalizó en 1971. Esto sucedió en la primera conferencia sobre ingeniería enzimológica. En la actualidad, el concepto de enzimas inmovilizadas se considera en un sentido más amplio que a finales del siglo XX. Echemos un vistazo más de cerca a esta categoría.
Información general
Las enzimas inmovilizadas son compuestos que se unen artificialmente a un vehículo insoluble. Sin embargo, conservan sus propiedades catalíticas. Actualmente, este proceso se considera en dos aspectos: en el marco de la limitación parcial y completa de la libertad de movimiento de las moléculas de proteína.
Dignidad
Los científicos han establecido ciertos beneficios de las enzimas inmovilizadas. Actuando como catalizadores heterogéneos, pueden separarse fácilmente del medio de reacción. Como parte de la investigación, se encontró que el uso de enzimas inmovilizadas se puede repetir. Durante el proceso de vinculación, las conexiones cambian sus propiedades. Adquieren especificidad de sustrato y estabilidad. Al mismo tiempo, su actividad comienza a depender de las condiciones ambientales. Las enzimas inmovilizadas son duraderas y tienen un alto grado de estabilidad. Es mayor que, por ejemplo, el de las enzimas libres por miles, decenas de miles de veces. Todo esto asegura una alta eficiencia, competitividad y economía de las tecnologías en las que están presentes las enzimas inmovilizadas.
Medios
J. Poratu identificó las propiedades clave de los materiales ideales para ser utilizados en la inmovilización. Los portadores deben tener:
- Insolubilidad.
- Alta resistencia biológica y química.
- La capacidad de activarse rápidamente. Los portadores deberían volverse fácilmente reactivos.
- Hidrofilia significativa.
- Permeabilidad necesaria. Su indicador debe ser igualmente aceptable tanto para enzimas como para coenzimas, productos de reacción y sustratos.
Actualmente no existe ningún material que cumpla plenamente con estos requisitos. No obstante, en la práctica, se utilizan transportadores que son adecuados para la inmovilización.cierta categoría de enzimas bajo condiciones específicas.
Clasificación
Dependiendo de su naturaleza, los materiales, en relación con los cuales los compuestos se convierten en enzimas inmovilizadas, se dividen en inorgánicos y orgánicos. La unión de muchos compuestos se lleva a cabo con soportes poliméricos. Estos materiales orgánicos se dividen en 2 clases: sintéticos y naturales. En cada uno de ellos, a su vez, se distinguen grupos según la estructura. Los portadores inorgánicos están representados principalmente por materiales hechos de vidrio, cerámica, arcilla, gel de sílice y grafito negro. Cuando se trabaja con materiales, los métodos de química seca son populares. Las enzimas inmovilizadas se obtienen mediante el recubrimiento de soportes con una película de óxidos de titanio, aluminio, circonio, hafnio o mediante procesamiento con polímeros orgánicos. Una ventaja importante de los materiales es la facilidad de regeneración.
Proteínas portadoras
Los más populares son los materiales de lípidos, polisacáridos y proteínas. Entre estos últimos, cabe destacar los polímeros estructurales. Estos incluyen principalmente colágeno, fibrina, queratina y gelatina. Dichas proteínas están ampliamente distribuidas en el entorno natural. Son asequibles y económicos. Además, tienen una gran cantidad de grupos funcionales para la unión. Las proteínas son biodegradables. Esto permite expandir el uso de enzimas inmovilizadas en medicina. Mientras tanto, las proteínas también tienen propiedades negativas. Las desventajas de usar enzimas inmovilizadas sobre proteínas transportadoras son la alta inmunogenicidad de estas últimas, así como lala capacidad de introducir solo ciertos grupos de ellos en las reacciones.
Polisacáridos, aminosacáridos
De estos materiales, los más utilizados son quitina, dextrano, celulosa, agarosa y sus derivados. Para hacer que los polisacáridos sean más resistentes a las reacciones, sus cadenas lineales se entrecruzan con epiclorhidrina. Varios grupos ionogénicos se introducen libremente en las estructuras de la red. La quitina se acumula en grandes cantidades como desecho durante el procesamiento industrial de camarones y cangrejos. Esta sustancia es resistente a los productos químicos y tiene una estructura porosa bien definida.
Polímeros sintéticos
Este grupo de materiales es muy diverso y accesible. Incluye polímeros a base de ácido acrílico, estireno, alcohol polivinílico, poliuretano y polímeros de poliamida. La mayoría de ellos son mecánicamente fuertes. En el proceso de transformación, brindan la posibilidad de variar el tamaño de poro dentro de un rango bastante amplio, introduciendo varios grupos funcionales.
Métodos de vinculación
Actualmente, hay dos opciones fundamentalmente diferentes para la inmovilización. El primero es obtener compuestos sin enlaces covalentes con el portador. Este método es físico. Otra opción implica la aparición de un enlace covalente con el material. Este es un método químico.
Adsorción
Con su ayuda, las enzimas inmovilizadas se obtienen manteniendo el fármaco en la superficie del soporte debido adispersión, interacciones hidrofóbicas, electrostáticas y puentes de hidrógeno. La adsorción fue la primera forma de limitar la movilidad de los elementos. Sin embargo, incluso ahora esta opción no ha perdido su relevancia. Además, la adsorción se considera el método de inmovilización más común en la industria.
Características del método
Las publicaciones científicas describen más de 70 enzimas obtenidas por el método de adsorción. Los portadores eran principalmente vidrio poroso, diversas arcillas, polisacáridos, óxidos de aluminio, polímeros sintéticos, titanio y otros metales. Estos últimos son los más utilizados. La eficacia de la adsorción del fármaco en el soporte está determinada por la porosidad del material y el área superficial específica.
Mecanismo de acción
La adsorción de enzimas en materiales insolubles es simple. Se logra por contacto de una solución acuosa del fármaco con el vehículo. Puede pasar de forma estática o dinámica. La solución de enzima se mezcla con sedimento fresco, por ejemplo, hidróxido de titanio. A continuación, el compuesto se seca en condiciones suaves. La actividad enzimática durante dicha inmovilización se retiene casi en un 100%. Al mismo tiempo, la concentración específica alcanza los 64 mg por gramo de portador.
Momentos negativos
Las desventajas de la adsorción incluyen una baja resistencia al unir la enzima y el transportador. En el proceso de cambio de las condiciones de reacción, se pueden observar pérdidas de elementos, contaminación de productos y desorción de proteínas. Para mejorar la fuerzalos portadores de enlace están modificados previamente. En particular, los materiales se tratan con iones metálicos, polímeros, compuestos hidrofóbicos y otros agentes polifuncionales. En algunos casos, se modifica el propio fármaco. Pero muy a menudo esto conduce a una disminución de su actividad.
Inclusión en el gel
Esta opción es bastante común debido a su singularidad y simplicidad. Este método es adecuado no solo para elementos individuales, sino también para complejos multienzimáticos. La incorporación al gel se puede realizar de dos formas. En el primer caso, el fármaco se combina con una solución acuosa del monómero, después de lo cual se realiza la polimerización. Como resultado, aparece una estructura de gel espacial que contiene moléculas enzimáticas en las células. En el segundo caso, el medicamento se introduce en la solución del polímero terminado. Luego se pone en estado de gel.
Intrusión en estructuras translúcidas
La esencia de este método de inmovilización es la separación de una solución enzimática acuosa del sustrato. Para ello, se utiliza una membrana semipermeable. Permite el paso de elementos de bajo peso molecular de cofactores y sustratos y retiene grandes moléculas de enzimas.
Microencapsulación
Hay varias opciones para empotrar en estructuras translúcidas. De estos, la microencapsulación y la incorporación de proteínas en liposomas son los de mayor interés. La primera opción fue propuesta en 1964 por T. Chang. Consiste en que la solución enzimática se introduce en una cápsula cerrada, cuyas paredes están hechas de semipermeablepolímero. La aparición de una membrana en la superficie se debe a la reacción de policondensación interfacial de los compuestos. Uno de ellos se disuelve en la fase orgánica y el otro en la fase acuosa. Un ejemplo es la formación de una microcápsula obtenida por policondensación de halogenuro de ácido sebácico (fase orgánica) y hexametilendiamina-1,6 (fase acuosa respectivamente). El espesor de la membrana se calcula en centésimas de micrómetro. El tamaño de las cápsulas es de cientos o decenas de micrómetros.
Incorporación en liposomas
Este método de inmovilización está cerca de la microencapsulación. Los liposomas se presentan en sistemas laminares o esféricos de bicapas lipídicas. Este método se utilizó por primera vez en 1970. Para aislar los liposomas de una solución de lípidos, se evapora el disolvente orgánico. La película delgada restante se dispersa en una solución acuosa en la que está presente la enzima. Durante este proceso, se produce el autoensamblaje de estructuras de bicapa lipídica. Tales enzimas inmovilizadas son bastante populares en medicina. Esto se debe a que la mayoría de las moléculas están localizadas en la matriz lipídica de las membranas biológicas. Las enzimas inmovilizadas incluidas en los liposomas son el material de investigación más importante en medicina, lo que permite estudiar y describir los patrones de los procesos vitales.
Formación de nuevos bonos
La inmovilización mediante la formación de nuevas cadenas covalentes entre enzimas y transportadores se considera el método más extendido para la obtención de biocatalizadores industriales.destino. A diferencia de los métodos físicos, esta opción proporciona un enlace fuerte e irreversible entre la molécula y el material. Su formación suele ir acompañada de una estabilización del fármaco. Al mismo tiempo, la ubicación de la enzima a una distancia del primer enlace covalente con respecto al soporte crea ciertas dificultades en la implementación del proceso catalítico. La molécula se separa del material por medio de un inserto. A menudo se utiliza como agentes poli y bifuncionales. En particular, son la hidracina, el bromuro de cianógeno, el dialedruro glutárico, el cloruro de sulfurilo, etc. Por ejemplo, para eliminar la galactosiltransferasa, se inserta la siguiente secuencia entre el transportador y la enzima -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. En tal situación, en la estructura están presentes un inserto, una molécula y un portador. Todos ellos están conectados por enlaces covalentes. De fundamental importancia es la necesidad de introducir en la reacción grupos funcionales que no son esenciales para la función catalítica del elemento. Entonces, como regla general, las glicoproteínas se unen al transportador no a través de la proteína, sino a través de la parte de carbohidratos. Como resultado, se obtienen enzimas inmovilizadas más estables y activas.
Células
Los métodos descritos anteriormente se consideran universales para todos los tipos de biocatalizadores. Estos incluyen, entre otras cosas, células, estructuras subcelulares, cuya inmovilización se ha generalizado recientemente. Esto se debe a lo siguiente. Cuando las células están inmovilizadas, no hay necesidad de aislar y purificar las preparaciones de enzimas ni de introducir cofactores en las reacciones. Como resultado, se hace posiblesistemas que llevan a cabo procesos continuos de varias etapas.
Uso de enzimas inmovilizadas
En la medicina veterinaria, la industria y otros sectores económicos, los medicamentos obtenidos por los métodos anteriores son muy populares. Los enfoques desarrollados en la práctica brindan una solución a los problemas de administración dirigida de fármacos en el cuerpo. Las enzimas inmovilizadas permitieron obtener fármacos de acción prolongada con alergenicidad y toxicidad mínimas. Actualmente, los científicos están resolviendo los problemas asociados con la bioconversión de masa y energía utilizando enfoques microbiológicos. Mientras tanto, la tecnología de enzimas inmovilizadas también hace una contribución significativa al trabajo. Las perspectivas de desarrollo parecen ser bastante amplias. Entonces, en el futuro, uno de los roles clave en el proceso de monitoreo del estado del medio ambiente debería pertenecer a nuevos tipos de análisis. En particular, estamos hablando de métodos bioluminiscentes y de inmunoensayo enzimático. Los enfoques avanzados son de particular importancia en el procesamiento de materias primas lignocelulósicas. Las enzimas inmovilizadas se pueden utilizar como amplificadores de señales débiles. El centro activo puede estar bajo la influencia de un portador que está bajo ultrasonido, estrés mecánico o sujeto a transformaciones fitoquímicas.
