Proteína recombinante: métodos de producción y aplicaciones

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Proteína recombinante: métodos de producción y aplicaciones
Proteína recombinante: métodos de producción y aplicaciones
Anonim

La proteína es un componente esencial de todos los organismos. Cada una de sus moléculas consta de una o más cadenas polipeptídicas formadas por aminoácidos. Aunque la información necesaria para la vida está codificada en el ADN o el ARN, las proteínas recombinantes realizan una amplia gama de funciones biológicas en los organismos, incluida la catálisis enzimática, la protección, el apoyo, el movimiento y la regulación. De acuerdo con sus funciones en el cuerpo, estas sustancias se pueden dividir en diferentes categorías, como anticuerpos, enzimas, componente estructural. Dadas sus importantes funciones, estos compuestos han sido intensamente estudiados y ampliamente utilizados.

expresión de laboratorio
expresión de laboratorio

En el pasado, la forma principal de obtener una proteína recombinante era aislarla de una fuente natural, lo que suele ser ineficiente y lento. Avances recientes en tecnología molecular biológica han hecho posible clonar ADN que codifica un conjunto específico de sustancias en un vector de expresión para sustancias como bacterias, levaduras, células de insectos y células de mamíferos.

En pocas palabras, los productos de ADN exógeno traducen las proteínas recombinantes enCélulas vivas. Obtenerlos generalmente implica dos pasos principales:

  1. Clonando una molécula.
  2. Expresión de proteínas.

Actualmente, la producción de tal estructura es uno de los métodos más poderosos usados en medicina y biología. La composición tiene una amplia aplicación en investigación y biotecnología.

Dirección médica

Las proteínas recombinantes brindan importantes tratamientos para varias enfermedades como la diabetes, el cáncer, las enfermedades infecciosas, la hemofilia y la anemia. Las formulaciones típicas de dichas sustancias incluyen anticuerpos, hormonas, interleucinas, enzimas y anticoagulantes. Existe una necesidad creciente de formulaciones recombinantes para uso terapéutico. Le permiten ampliar los métodos de tratamiento.

Las proteínas recombinantes modificadas genéticamente desempeñan un papel clave en el mercado de fármacos terapéuticos. Las células de mamíferos actualmente producen la mayoría de los agentes terapéuticos porque sus formulaciones son capaces de producir sustancias de alta calidad similares a las naturales. Además, muchas proteínas terapéuticas recombinantes aprobadas se producen en E. coli debido a la buena genética, el rápido crecimiento y la alta productividad. También tiene un efecto positivo en el desarrollo de fármacos basados en esta sustancia.

Investigación

La obtención de proteínas recombinantes se basa en diferentes métodos. Las sustancias ayudan a descubrir los principios básicos y fundamentales del cuerpo. Estas moléculas se pueden utilizar para identificar y determinarubicación de la sustancia codificada por un gen en particular, y para revelar la función de otros genes en diversas actividades celulares, como señalización celular, metabolismo, crecimiento, replicación y muerte, transcripción, traducción y modificación de los compuestos discutidos en el artículo.

Métodos modernos de obtención
Métodos modernos de obtención

Por lo tanto, la composición observada se usa a menudo en biología molecular, biología celular, bioquímica, estudios estructurales y biofísicos y muchos otros campos de la ciencia. Al mismo tiempo, la obtención de proteínas recombinantes es una práctica internacional.

Estos compuestos son herramientas útiles para comprender las interacciones intercelulares. Han demostrado su eficacia en varios métodos de laboratorio, como ELISA e inmunohistoquímica (IHC). Las proteínas recombinantes se pueden utilizar para desarrollar ensayos enzimáticos. Cuando se usan en combinación con un par de anticuerpos apropiados, las células se pueden usar como estándares para nuevas tecnologías.

Biotecnología

Las proteínas recombinantes que contienen una secuencia de aminoácidos también se utilizan en la industria, la producción de alimentos, la agricultura y la bioingeniería. Por ejemplo, en la cría de animales, se pueden agregar enzimas a los alimentos para aumentar el valor nutricional de los ingredientes de los alimentos, reducir los costos y los desechos, apoyar la salud intestinal de los animales, mejorar la productividad y mejorar el medio ambiente.

edición genética
edición genética

Además, las bacterias del ácido láctico (LAB) durante mucho tiempose han utilizado para producir alimentos fermentados, y recientemente se han desarrollado LAB para la expresión de proteínas recombinantes que contienen una secuencia de aminoácidos, que pueden utilizarse ampliamente, por ejemplo, para mejorar la digestión humana, animal y nutricional.

Sin embargo, estas sustancias también tienen limitaciones:

  1. En algunos casos, la producción de proteínas recombinantes es compleja, costosa y requiere mucho tiempo.
  2. Las sustancias producidas en las células pueden no coincidir con las formas naturales. Esta diferencia puede reducir la efectividad de las proteínas recombinantes terapéuticas e incluso causar efectos secundarios. Además, esta diferencia puede afectar los resultados de los experimentos.
  3. El principal problema de todos los fármacos recombinantes es la inmunogenicidad. Todos los productos biotecnológicos pueden exhibir alguna forma de inmunogenicidad. Es difícil predecir la seguridad de las nuevas proteínas terapéuticas.

En general, los avances en biotecnología han aumentado y facilitado la producción de proteínas recombinantes para una variedad de aplicaciones. Aunque todavía tienen algunos inconvenientes, las sustancias son importantes en medicina, investigación y biotecnología.

Enlace de enfermedad

La proteína recombinante no es dañina para los humanos. Es solo una parte integral de la molécula general en el desarrollo de un fármaco o elemento nutricional en particular. Muchos estudios médicos han demostrado que la expresión forzada de la proteína FGFBP3 (abreviada BP3) en una cepa de laboratorio de ratones obesos mostró una reducción significativa en su grasa corporal.masa, a pesar de la predisposición genética al uso.

Los resultados de estos ensayos muestran que la proteína FGFBP3 puede ofrecer una nueva terapia para los trastornos asociados con el síndrome metabólico, como la diabetes tipo 2 y la enfermedad del hígado graso. Pero debido a que BP3 es una proteína natural y no una droga artificial, los ensayos clínicos de BP3 humana recombinante podrían comenzar después de la última ronda de estudios preclínicos. En, es decir, hay razones relacionadas con la seguridad de la realización de este tipo de estudios. La proteína recombinante no es dañina para los humanos debido a su procesamiento y purificación gradual. También se están produciendo cambios a nivel molecular.

PD-L2, uno de los actores clave en inmunoterapia, fue nominado para el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2018. Este trabajo, iniciado por el Prof. James P. Allison de EE. UU. y el Prof. Tasuku Honjo de Japón, ha llevado al tratamiento de cánceres como el melanoma, el cáncer de pulmón y otros basados en la inmunoterapia de punto de control. Recientemente, AMSBIO ha agregado un importante producto nuevo a su línea de inmunoterapia, el activador PD-L2/TCR - Línea celular recombinante CHO.

En experimentos de prueba de concepto, investigadores de la Universidad de Alabama en Birmingham, dirigidos por el Dr. H. Long Zheng, el profesor Robert B. Adams y el director de Medicina de Laboratorio, Departamento de Patología, Escuela de Medicine, han destacado una terapia potencial para un trastorno hemorrágico raro pero fatal, TTP.

Los resultados de estoLos estudios demuestran por primera vez que la transfusión de plaquetas cargadas con rADAMTS13 puede ser un enfoque terapéutico novedoso y potencialmente eficaz para la trombosis arterial asociada con la PTT congénita y mediada por el sistema inmunitario.

La proteína recombinante no es solo un nutriente, sino también un fármaco en la composición del fármaco que se está desarrollando. Estas son solo algunas de las áreas que ahora están involucradas en la medicina y relacionadas con el estudio de todos sus elementos estructurales. Como muestra la práctica internacional, la estructura de una sustancia hace posible a nivel molecular tratar muchos problemas serios en el cuerpo humano.

Desarrollo de vacunas

Una proteína recombinante es un conjunto específico de moléculas que se pueden modelar. Una propiedad similar se utiliza en el desarrollo de vacunas. Una nueva estrategia de vacunación, también conocida como el uso de una inyección especial de virus recombinante, podría proteger a millones de pollos en riesgo de una enfermedad respiratoria grave, dijeron investigadores de la Universidad de Edimburgo y el Instituto Pirbright. Estas vacunas usan versiones inofensivas o débiles de un virus o una bacteria para introducir gérmenes en las células del cuerpo. En este caso, los expertos utilizaron virus recombinantes con diferentes proteínas de punta como vacunas para crear dos versiones de un virus inofensivo. Hay muchas drogas diferentes basadas en esta conexión.

Nuevo enfoque de tratamiento
Nuevo enfoque de tratamiento

Los nombres comerciales y análogos de las proteínas recombinantes son los siguientes:

  1. "Fortelizina".
  2. "Z altrap".
  3. "Eylea".

Estos son principalmente medicamentos contra el cáncer, pero hay otras áreas de tratamiento asociadas con esta sustancia activa.

Una nueva vacuna, también llamada LASSARAB, diseñada para proteger a las personas contra la fiebre de Lassa y la rabia, ha mostrado resultados prometedores en estudios preclínicos, según un nuevo estudio publicado en la revista científica Nature Communications. Una candidata a vacuna recombinante inactivada utiliza un virus de la rabia debilitado.

El equipo de investigación insertó material genético del virus de Lassa en un vector del virus de la rabia para que la vacuna expresara proteínas de superficie tanto en las células de Lassa como en las de la rabia. Estos compuestos de superficie provocan una respuesta inmunitaria contra agentes infecciosos. Luego, esta vacuna se inactivó para "destruir" el virus vivo de la rabia que se usó para hacer el portador.

Cómo obtener métodos

Hay varios sistemas para producir una sustancia. El método general para la obtención de una proteína recombinante se basa en la obtención de material biológico a partir de la síntesis. Pero hay otras formas.

Actualmente hay cinco sistemas de expresión principales:

  1. Sistema de expresión de E. coli.
  2. Sistema de expresión de levadura.
  3. Sistema de expresión de células de insectos.
  4. Sistema de expresión de células de mamíferos.
  5. Sistema de expresión de proteínas libre de células.

Esta última opción es especialmente adecuada para la expresión de proteínas transmembranay compuestos tóxicos. En los últimos años, sustancias que son difíciles de expresar por métodos intracelulares convencionales se han integrado con éxito en células in vitro. En Bielorrusia, la producción de proteínas recombinantes se usa ampliamente. Hay una serie de empresas estatales que se ocupan de este problema.

Cell Free Protein Synthesis System es un método rápido y eficaz para sintetizar sustancias diana mediante la adición de diversos sustratos y compuestos energéticos necesarios para la transcripción y traducción en el sistema enzimático de extractos celulares. En los últimos años, las ventajas de los métodos libres de células para tipos de sustancias como membranas complejas y tóxicas han ido surgiendo gradualmente, demostrando su potencial aplicación en el campo biofarmacéutico.

La tecnología sin células puede agregar una variedad de aminoácidos no naturales fácilmente y de manera controlada para lograr procesos de modificación complejos que son difíciles de resolver después de la expresión recombinante convencional. Dichos métodos tienen un alto valor de aplicación y potencial para la administración de fármacos y el desarrollo de vacunas utilizando partículas similares a virus. Un gran número de proteínas de membrana se han expresado con éxito en células libres.

Expresión de composiciones

La proteína recombinante CFP10-ESAT 6 se produce y se utiliza para crear vacunas. Tal alérgeno de tuberculosis le permite fortalecer el sistema inmunológico y desarrollar anticuerpos. En general, los estudios moleculares implican el estudio de cualquier aspecto de una proteína, como estructura, función, modificaciones, localización o interacciones. Para explorarcómo las sustancias específicas regulan los procesos internos, los investigadores generalmente requieren los medios para producir compuestos funcionales de interés y beneficio.

Creando Vacunas
Creando Vacunas

Dado el tamaño y la complejidad de las proteínas, la síntesis química no es una opción viable para este esfuerzo. En cambio, las células vivas y su maquinaria celular se utilizan generalmente como fábricas para crear y construir sustancias basadas en las plantillas genéticas proporcionadas. El sistema de expresión de proteína recombinante luego genera la estructura necesaria para crear un fármaco. Luego viene la selección del material necesario para las diferentes categorías de medicamentos.

A diferencia de las proteínas, el ADN es fácil de construir sintéticamente o in vitro utilizando técnicas recombinantes bien establecidas. Por lo tanto, las plantillas de ADN de genes específicos, con o sin secuencias indicadoras añadidas o secuencias de etiquetas de afinidad, pueden diseñarse como plantillas para la expresión de la sustancia monitoreada. Estos compuestos derivados de dichas plantillas de ADN se denominan proteínas recombinantes.

Las estrategias tradicionales para la expresión de una sustancia implican transfectar células con un vector de ADN que contiene una plantilla y luego cultivar las células para transcribir y traducir la proteína deseada. Por lo general, las células luego se lisan para extraer el compuesto expresado para su posterior purificación. La proteína recombinante CFP10-ESAT6 se procesa de esta forma y pasa por un sistema de purificación de posiblesla formación de toxinas. Solo después de eso se sintetizará en una vacuna.

Los sistemas de expresión in vivo tanto procarióticos como eucarióticos para sustancias moleculares son ampliamente utilizados. La elección del sistema depende del tipo de proteína, el requerimiento de actividad funcional y el rendimiento deseado. Estos sistemas de expresión incluyen mamíferos, insectos, levaduras, bacterias, algas y células. Cada sistema tiene sus propias ventajas y desafíos, y elegir el sistema correcto para una aplicación en particular es importante para la expresión exitosa de la sustancia bajo revisión.

Expresión de los mamíferos

El uso de proteínas recombinantes permite el desarrollo de vacunas y fármacos de varios niveles. Para ello, se puede utilizar este método de obtención de una sustancia. Los sistemas de expresión de mamíferos se pueden usar para producir proteínas del reino animal que tienen la estructura y actividad más nativas debido a su entorno fisiológicamente relevante. Esto da como resultado altos niveles de procesamiento postraduccional y actividad funcional. Los sistemas de expresión de mamíferos se pueden usar para producir anticuerpos, proteínas complejas y compuestos para usar en ensayos funcionales basados en células. Sin embargo, estos beneficios se combinan con condiciones de cultivo más estrictas.

Los sistemas de expresión de mamíferos se pueden utilizar para generar proteínas de forma transitoria oa través de líneas celulares estables en las que la construcción de expresión se integra en el genoma del huésped. Si bien tales sistemas se pueden usar en múltiples experimentos, el tiempola producción puede generar una gran cantidad de sustancia en una o dos semanas. Este tipo de biotecnología de proteínas recombinantes tiene una gran demanda.

Estos sistemas de expresión de mamíferos transitorios y de alto rendimiento utilizan cultivos en suspensión y pueden producir gramos por litro. Además, estas proteínas tienen más plegamiento nativo y modificaciones postraduccionales, como la glicosilación, en comparación con otros sistemas de expresión.

Expresión de insectos

Los métodos para producir proteínas recombinantes no se limitan a los mamíferos. También existen formas más productivas en cuanto a costes de producción, aunque el rendimiento de la sustancia por 1 litro de líquido tratado es mucho menor.

Ensayos clínicos
Ensayos clínicos

Las células de insecto se pueden utilizar para expresar una proteína de alto nivel con modificaciones similares a los sistemas de los mamíferos. Hay varios sistemas que se pueden usar para generar baculovirus recombinantes, que luego se pueden usar para extraer la sustancia de interés en células de insectos.

Las expresiones de proteínas recombinantes se pueden ampliar y adaptar fácilmente al cultivo en suspensión de alta densidad para la composición de moléculas a gran escala. Son más similares funcionalmente a la composición nativa de la materia de los mamíferos. Aunque el rendimiento puede ser de hasta 500 mg/l, la producción de baculovirus recombinantes puede llevar mucho tiempo y las condiciones de cultivo son más difíciles que en los sistemas procarióticos. Sin embargo, en países más al sur y más cálidos, unmétodo se considera más eficiente.

Expresión bacteriana

La producción de proteínas recombinantes se puede establecer con la ayuda de bacterias. Esta tecnología es muy diferente de las descritas anteriormente. Los sistemas de expresión de proteínas bacterianas son populares porque las bacterias son fáciles de cultivar, crecen rápidamente y dan altos rendimientos de la formulación recombinante. Sin embargo, las sustancias eucariotas multidominio expresadas en bacterias a menudo no son funcionales porque las células no están equipadas para realizar las modificaciones postraduccionales o el plegamiento molecular necesarios.

Además, muchas proteínas se vuelven insolubles como moléculas de inclusión, que son muy difíciles de recuperar sin desnaturalizadores agresivos y los engorrosos procedimientos posteriores de replegamiento molecular. Este método se considera en su mayoría como todavía en gran parte experimental.

Expresión libre de células

La proteína recombinante que contiene la secuencia de aminoácidos de la estafiloquinasa se obtiene de una manera ligeramente diferente. Se incluye en muchos tipos de inyecciones, lo que requiere varios sistemas antes de su uso.

La expresión de proteínas libres de células es una síntesis in vitro de una sustancia utilizando extractos de células enteras compatibles con la traducción. En principio, los extractos de células enteras contienen todas las macromoléculas y componentes necesarios para la transcripción, traducción e incluso la modificación postraduccional.

Estos componentes incluyen ARN polimerasa, factores de proteína reguladores, formas de transcripción, ribosomas y ARNt. Al agregarcofactores, nucleótidos y una plantilla genética específica, estos extractos pueden sintetizar proteínas de interés en unas pocas horas.

Aunque no son sostenibles para la producción a gran escala, los sistemas de expresión de proteínas (IVT) in vitro o libres de células ofrecen una serie de ventajas sobre los sistemas in vivo convencionales.

La expresión libre de células permite la síntesis rápida de formulaciones recombinantes sin involucrar cultivo celular. Los sistemas sin células permiten marcar proteínas con aminoácidos modificados, así como expresar compuestos que sufren una rápida degradación proteolítica por proteasas intracelulares. Además, es más fácil expresar muchas proteínas diferentes al mismo tiempo utilizando un método libre de células (por ejemplo, probar mutaciones de proteínas mediante la expresión a pequeña escala de muchas plantillas de ADN recombinante diferentes). En este experimento representativo, se utilizó el sistema IVT para expresar la proteína caspasa-3 humana.

Conclusiones y perspectivas de futuro

La producción de proteínas recombinantes puede verse ahora como una disciplina madura. Este es el resultado de numerosas mejoras incrementales en la purificación y el análisis. Actualmente, los programas de descubrimiento de fármacos rara vez se detienen debido a la incapacidad de producir la proteína objetivo. Los procesos paralelos para la expresión, purificación y análisis de varias sustancias recombinantes ahora son bien conocidos en muchos laboratorios de todo el mundo.

ingredientes naturales
ingredientes naturales

Complejos proteicos y éxito creciente en la fabricaciónlas estructuras de membrana solubilizadas requerirán más cambios para satisfacer la demanda. El surgimiento de organizaciones de investigación por contrato efectivas para un suministro más regular de proteínas permitirá la reasignación de recursos científicos para enfrentar estos nuevos desafíos.

Además, los flujos de trabajo paralelos deberían permitir la creación de bibliotecas completas de la sustancia monitoreada para permitir la identificación de nuevos objetivos y la detección avanzada, junto con los proyectos tradicionales de descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas.

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