¿Qué subyace en la hibridación del ADN? Aunque la secuencia de ADN de doble cadena es generalmente estable en condiciones fisiológicas, el cambio de estas condiciones en el laboratorio (normalmente elevando la temperatura ambiente) hará que las moléculas se separen en cadenas individuales. Estos últimos son complementarios entre sí, pero también pueden complementar otras secuencias presentes en su entorno. La reducción de la temperatura ambiente permite que las moléculas monocatenarias se hibriden o "hibridan" entre sí. Este es el método de hibridación de ADN.
El concepto desde el punto de vista de la biología molecular
Los científicos involucrados tanto en la replicación del ADN como en la transcripción de ADN en ARN confían en cruces de nucleótidos y técnicas de biología molecular. Esto incluye las transferencias Southern y Northern, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la mayoría de los enfoques de hibridación y secuenciación de ADN-ARN.
Solicitud
La hibridación es la principal propiedad de los nucleótidossecuencias y se utiliza en numerosos métodos de biología molecular. La relación genética general de dos especies se puede determinar mediante la hibridación de segmentos de su ADN (hibridación ADN-ADN). Debido a las similitudes de secuencia entre organismos estrechamente relacionados, se requiere una temperatura más alta para fundir dichos híbridos de ADN en comparación con organismos más distantes. Varios métodos utilizan la hibridación para determinar el origen de una muestra de ADN, incluida la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En otro método, las secuencias cortas de ADN se hibridan con el ARNm celular para identificar los genes expresados. Las compañías farmacéuticas están explorando el uso de ARN antisentido para unirse a ARNm no deseado, evitando que el ribosoma traduzca el ARNm en proteína.
La hibridación ADN-ADN generalmente se refiere a una técnica de biología molecular que mide el grado de similitud genética entre grupos de secuencias de ADN. Se utiliza comúnmente para determinar la distancia genética entre dos organismos. Ha sido ampliamente utilizado en filogenia y taxonomía.
Metodología
ADN de un organismo se marcó, luego se mezcló con ADN sin marcar que podría compararse con él. La mezcla se incuba para permitir que las cadenas de ADN se disocien y luego se enfríe para formar un ADN de doble cadena híbrido regenerado. Las secuencias hibridadas con un alto grado de similitud se unirán con más fuerza y requerirán más energía para separarlas: es decir, se separan cuando se calientan a una temperatura más alta.temperatura que secuencias diferentes, un proceso conocido como "fusión de ADN".
ADN derritiéndose
Al evaluar el perfil de fusión del ADN hibridado, el ADN de doble cadena se une a una denominada "columna" y la mezcla resultante se calienta. En cada paso, la columna se lava y las secuencias de ADN que se funden se vuelven monocatenarias y se lavan de la columna. Las temperaturas a las que el ADN marcado sale de la columna reflejan la cantidad de similitud entre las secuencias (y el patrón de autoplegamiento sirve como control). Estos resultados se combinan para determinar el grado de similitud genética entre organismos. Según la microbiología moderna, la hibridación del ADN es imposible sin entender estas cosas.
Cuando se comparan múltiples especies de ácido ribonucleico (o desoxirribonucleico) de esta manera, los valores de similitud permiten colocar las especies en el árbol filogenético. Por lo tanto, este es uno de los posibles enfoques para llevar a cabo la sistemática molecular. Charles Sibley y John Ahlquist, los pioneros de esta técnica, utilizaron la hibridación ADN-ADN para estudiar las relaciones filogenéticas de las aves (taxonomía Sibley-Ahlquist) y los primates.
Importancia para la biología
La hibridación ADN-ADN es el estándar de oro para distinguir especies bacterianas, con un valor de similitud de más del 70%, lo que indica que las cepas comparadas pertenecen a especies diferentes. En 2014, se propuso un umbral del 79 % de similitud para separar una subespecie bacteriana.
Los críticos sostienen que la técnica es inexacta para comparar especies estrechamente relacionadas, ya que cualquier intento de medir las diferencias entre secuencias ortólogas entre organismos se ve abrumado por la hibridación de contrapartes parálogas en el genoma de un organismo. La secuenciación de ADN y las comparaciones de secuencias computacionales son actualmente el método comúnmente utilizado para determinar la distancia genética, aunque este enfoque todavía se usa en microbiología para ayudar a identificar bacterias.
La forma actual es realizar la hibridación ADN-ADN en silicona utilizando genomas total o parcialmente secuenciados. El GGDC desarrollado por DSMZ es la herramienta conocida más precisa para calcular valores similares a DDH. Entre otras mejoras algorítmicas, resuelve el problema de las secuencias parálogas filtrándolas cuidadosamente para eliminar las coincidencias entre dos secuencias genómicas.
método FISH
La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) es una técnica de laboratorio utilizada para detectar y secuenciar el ADN, a menudo en un cromosoma específico.
En 1969, Joseph Gall y Mary Lou Pardu publicaron un artículo que demostraba que las copias radiactivas de una secuencia de ADN ribosomal podían usarse para detectar secuencias de ADN complementarias en el núcleo de un óvulo de rana. Desde estas observaciones originales, muchos refinamientos han aumentado la versatilidad yla sensibilidad del procedimiento hasta tal punto que la hibridación in situ ("en lugar", latín) ahora se considera una herramienta importante en citogenética. (El término in situ ahora también se usa para referirse a la etapa inicial del crecimiento del carcinoma, cuando solo el tejido epitelial está involucrado en el proceso patológico).
Secuencia de hibridación fluorescente
Las sondas de ARN se pueden diseñar para cualquier gen o cualquier secuencia dentro de un gen para visualizar ARNlnc y ARNm de miARN en tejidos y células. FISH se utiliza para estudiar el ciclo de reproducción celular, en particular la interfase nuclear para cualquier anomalía cromosómica. FISH le permite analizar una gran serie de casos archivados, es mucho más fácil identificar el cromosoma identificado creando una sonda con una base cromosómica artificial que atraerá cromosomas similares.
Señales de hibridación para cada sonda cuando se detecta una anomalía nuclear: cada sonda de detección de mRNA y lncRNA consta de 20 pares de oligonucleótidos, cada par cubre un espacio de 40-50 pb. p. Las sondas usan química patentada para detectar ARNm.
Hibridación con sondas de ADN
Las sondas a menudo se fabrican a partir de fragmentos de ADN que han sido aislados, purificados y amplificados para su uso en el diseño del genoma humano. El tamaño del genoma humano es tan grande en comparación con la longitud que se puede secuenciar directamente que es necesario dividirlo enfragmentos En última instancia, estos fragmentos se ordenaron mediante la digestión de una copia de cada fragmento en unidades aún más pequeñas usando endonucleasas específicas de secuencia para medir el tamaño de cada fragmento pequeño usando cromatografía de exclusión por tamaño usando esta información para determinar dónde se superponen entre sí los fragmentos grandes..
Para preservar los elementos con sus secuencias de ADN individuales, los fragmentos se agregaron a un sistema de poblaciones bacterianas que se repiten constantemente. Las poblaciones clonales de bacterias, cada una de las cuales mantiene un único cromosoma artificial, se almacenan en varios laboratorios de todo el mundo. Los cromosomas artificiales (BAC) se pueden cultivar, extraer y etiquetar en cualquier laboratorio que tenga una biblioteca. Las bibliotecas genómicas a menudo reciben el nombre de las instituciones donde se desarrollaron. Un ejemplo es la biblioteca RPCI-11, llamada así por el Roswell Cancer Institute de Buffalo (Nueva York, EE. UU.). Estos fragmentos componen alrededor de 100 mil pares de bases y son la base de la mayoría de las sondas FISH.
