La absorción y posterior reemisión de luz por medios inorgánicos y orgánicos es el resultado de la fosforescencia o la fluorescencia. La diferencia entre los fenómenos es la longitud del intervalo entre la absorción de luz y la emisión de la corriente. Con la fluorescencia, estos procesos ocurren casi simultáneamente, y con la fosforescencia, con cierto retraso.
Antecedentes históricos
En 1852, el científico británico Stokes describió por primera vez la fluorescencia. Acuñó el nuevo término como resultado de sus experimentos con espato flúor, que emitía luz roja cuando se exponía a la luz ultravioleta. Stokes notó un fenómeno interesante. Descubrió que la longitud de onda de la luz fluorescente siempre es más larga que la de la luz de excitación.
En el siglo XIX se llevaron a cabo muchos experimentos para confirmar la hipótesis. Demostraron que una variedad de muestras emiten fluorescencia cuando se exponen a la luz ultravioleta. Materiales incluidos, entre otros, cristales, resinas, minerales, clorofila,materias primas medicinales, compuestos inorgánicos, vitaminas, aceites. El uso directo de tintes para análisis biológicos comenzó recién en 1930
Descripción del microscopio de fluorescencia
Algunos de los materiales utilizados en la investigación en la primera mitad del siglo XX eran muy específicos. Gracias a los indicadores que no se podían lograr con los métodos de contraste, el método de microscopía de fluorescencia se ha convertido en una herramienta importante tanto en la investigación biomédica como biológica. Los resultados obtenidos fueron de no poca importancia para la ciencia de los materiales.
¿Cuáles son los beneficios de la microscopía de fluorescencia? Con la ayuda de nuevos materiales, fue posible aislar células altamente específicas y componentes submicroscópicos. Un microscopio fluorescente le permite detectar moléculas individuales. Una variedad de tintes le permiten identificar varios elementos al mismo tiempo. Aunque la resolución espacial del equipo está limitada por el límite de difracción, que a su vez depende de las propiedades específicas de la muestra, la detección de moléculas por debajo de este nivel también es bastante posible. Varias muestras exhiben autofluorescencia después de la irradiación. Este fenómeno es ampliamente utilizado en petrología, botánica, industria de semiconductores.
Características
El estudio de tejidos animales o microorganismos patógenos a menudo se complica por una autofluorescencia no específica demasiado débil o muy fuerte. Sin embargo, el valor enLa investigación adquiere la introducción en el material de componentes excitados a una determinada longitud de onda y que emiten un flujo luminoso de la intensidad requerida. Los fluorocromos actúan como tintes capaces de autoadherirse a las estructuras (invisibles o visibles). Al mismo tiempo, se distinguen por una alta selectividad con respecto a los objetivos y el rendimiento cuántico.
La microscopía de fluorescencia se ha vuelto ampliamente utilizada con la llegada de los tintes naturales y sintéticos. Tenían perfiles de intensidad de emisión y excitación específicos y estaban dirigidos a objetivos biológicos específicos.
Identificación de moléculas individuales
A menudo, en condiciones ideales, puede registrar el brillo de un solo elemento. Para hacer esto, entre otras cosas, es necesario asegurar un ruido del detector y un fondo óptico suficientemente bajos. Una molécula de fluoresceína puede emitir hasta 300.000 fotones antes de su destrucción por fotoblanqueo. Con una tasa de cobranza del 20% y eficiencia de proceso, se pueden registrar por un monto aproximado de 60 mil
La microscopía de fluorescencia, basada en fotodiodos de avalancha o multiplicación de electrones, permitió a los investigadores observar el comportamiento de moléculas individuales durante segundos y, en algunos casos, minutos.
Dificultades
El problema clave es la supresión del ruido del fondo óptico. Debido a que muchos de los materiales utilizados en la construcción de filtros y lentes presentan cierta autofluorescencia, los esfuerzos de los científicos en las etapas iniciales se centraron en emitircomponentes con baja fluorescencia. Sin embargo, experimentos posteriores llevaron a nuevas conclusiones. En particular, se ha descubierto que la microscopía de fluorescencia basada en la reflexión interna total logra un fondo bajo y una salida de luz de excitación alta.
Mecanismo
Los principios de la microscopía de fluorescencia basada en la reflexión interna total consisten en utilizar una onda que decae rápidamente o que no se propaga. Surge en la interfaz entre medios con diferentes índices de refracción. En este caso, el haz de luz pasa a través de un prisma. Tiene un alto índice de refracción.
El prisma está junto a una solución acuosa o un vidrio de bajo parámetro. Si el haz de luz se dirige hacia él con un ángulo mayor que el crítico, el haz se refleja completamente desde la interfaz. Este fenómeno, a su vez, da lugar a una onda que no se propaga. En otras palabras, se genera un campo electromagnético que penetra en un medio con un índice de refracción más bajo a una distancia de menos de 200 nanómetros.
En una onda que no se propaga, la intensidad de la luz será suficiente para excitar los fluoróforos. Sin embargo, debido a su excepcional poca profundidad, su volumen será muy pequeño. El resultado es un fondo de bajo nivel.
Modificación
La microscopía de fluorescencia basada en la reflexión interna total se puede realizar con epi-iluminación. Esto requiere lentes con mayor apertura numérica (al menos 1,4, pero es deseable que llegue a 1,45-1,6), así como un campo del aparato parcialmente iluminado. Esto último se consigue con una pequeña mancha. Para mayor uniformidad, se utiliza un anillo delgado, a través del cual se bloquea parte del flujo. Para obtener un ángulo crítico después del cual se produzca la reflexión total, se necesita un alto nivel de refracción del medio de inmersión en las lentes y el cubreobjetos del microscopio.
