Al estudiar sustancias en química orgánica, se utilizan más de una docena de reacciones cualitativas diferentes para determinar el contenido de ciertos compuestos. Dicho análisis visual le permite comprender de inmediato si las sustancias necesarias están presentes y, si no están presentes, puede reducir significativamente los experimentos adicionales para identificarlas. Estas reacciones incluyen ninhidrina, que es la principal en la determinación visual de compuestos amino.
¿Qué es esto?
La ninhidrina es un compuesto de dicarbonilo que contiene un anillo aromático con un heterociclo adjunto, cuyo segundo átomo tiene 2 grupos hidroxilo (OH-). Esta sustancia se obtiene por oxidación directa de la inandiona - 1,3 y, por tanto, según la nomenclatura internacional, tiene el siguiente nombre: 2,2 - dihidroxiinandiona -1,3 (Fig. 1).
La ninhidrina pura es un cristal amarillo o blancocolores que, cuando se calientan, se disuelven bien en agua y otros solventes orgánicos polares, como la acetona. Esta es una sustancia bastante dañina, si entra en contacto con la piel en grandes cantidades o con las membranas mucosas, causa irritación, incluso cuando se inhala. Se debe trabajar con este compuesto con cuidado y solo con guantes, ya que al entrar en contacto con la piel reacciona con las proteínas de las células de la piel y la tiñe de púrpura.
Sustancias reactivas
Como se mencionó anteriormente, la reacción de ninhidrina se usa principalmente para la determinación visual del contenido de compuestos amino:
- α-aminoácidos (incluso en proteínas);
- azúcares amino;
- alcaloides que contienen grupos –NH2 y -NH;
- aminas diversas.
Cabe señalar que las aminas secundarias y terciarias a veces reaccionan muy débilmente, por lo que se necesita más investigación para confirmar su presencia.
Se utilizan varios métodos de cromatografía para la determinación cuantitativa, por ejemplo, cromatografía en papel (BC), cromatografía en capa fina (TLC) o con lavado de portadores sólidos con una solución de ninhidrina en varios medios.
Esta reacción no es específica para los compuestos amino, ya que el reactivo puede entrar en ella con todos a la vez. Sin embargo, por parte de los productos de reacción, tiene una peculiaridad en la forma de liberación de burbujas de dióxido de carbono (CO2), y esto es típico solo cuando interactúa con α-amino ácidos.
Características del mecanismo
BExisten diferentes interpretaciones de la ecuación de reacción de la ninhidrina en la literatura. Algunos investigadores omiten la formación de hidrindantina a partir de la 2-aminoindiona, la cual, con la participación del amoníaco y la ninhidrina, también forma una sustancia colorante llamada "púrpura de Rueman" (o "azul de Rueman"), mientras que otros, por el contrario, asumen solo su participación sin la presencia de productos amino intermedios. También hay algunos puntos interesantes en el registro de la reacción en sí, en particular, esto se refiere a los métodos para unir el derivado amino de la ninhidrina a su molécula principal para formar un tinte. La indicación del lugar del “hidrógeno andante” obtenido por la amina intermedia del medio acuoso también sigue siendo cuestionable: puede estar en el grupo cetona o al lado de –NH2.
En realidad, el matiz con el átomo de H es insignificante, ya que su posición en el compuesto no juega un papel especial en el curso de la reacción, por lo que no se le debe prestar atención. En cuanto a la omisión de una de las posibles etapas, la razón aquí radica en el aspecto teórico: hasta ahora, el mecanismo exacto para la formación del púrpura de Rueman no se ha determinado con precisión, por lo que se pueden encontrar esquemas bastante diferentes de la reacción de la ninhidrina.
A continuación se propondrá el curso de interacción más completo posible del reactivo con los compuestos amino.
Mecanismo de reacción
Primero, la ninhidrina interactúa con el α-aminoácido, lo une al sitio de ruptura de los grupos hidroxi y forma un producto de condensación (Fig. 2a). Luego, este último se destruye, liberando la amina intermedia, el aldehído y el dióxido de carbono (Fig. 2b). Desde el producto final al unirseninhidrina, se sintetiza la estructura púrpura de Rueman (dicetonhidrindencetohidrinamina, Fig. 2c). También se indica la posible formación de hidrindantina (ninhidrina reducida) a partir de la amina intermedia, que también se convierte en un compuesto colorante en presencia de amoníaco (más precisamente, hidróxido de amonio) con un exceso del propio reactivo (Fig. 2d).
La formación de hidrindantina fue probada por el propio Rueman cuando el sulfuro de hidrógeno actúa sobre la molécula de ninhidrina. Este compuesto es capaz de disolverse en carbonato de sodio Na2CO3, coloreando la solución de rojo oscuro. Y cuando se agrega ácido clorhídrico diluido, la hidrindantina precipita.
Lo más probable es que la amina intermedia, la hidridantina, la ninhidrina y la estructura del colorante, debido a su inestabilidad al calentarse, estén en cierto equilibrio, lo que permite la presencia de varias etapas adicionales.
Este mecanismo es adecuado para explicar la reacción de la ninhidrina con otros compuestos amino, a excepción de los subproductos resultantes de la eliminación del resto de la estructura del –NH2, -NH o -N.
Prueba de Biuret y otras reacciones a proteínas
El análisis cualitativo de enlaces peptídicos, incluso de estructuras no proteicas, puede realizarse no solo con la participación del reactivo anterior. Sin embargo, en el caso de una reacción de ninhidrina a proteínas, la interacción no tiene lugar a lo largo de los grupos –CO-NH‒, sino a lo largo de los grupos amina. Existe la llamada "reacción de biuret", que se caracteriza por la adición de iones a la solución con compuestos amino.cobre bivalente a partir de CuSO4 o Cu(OH)2 en medio alcalino (Fig. 3).
Durante el análisis, en presencia de las estructuras necesarias, la solución se vuelve azul oscuro debido a la unión de los enlaces peptídicos en un complejo de color que distingue un reactivo de otro. Es por eso que las reacciones de biuret y ninhidrina son universales en relación con estructuras proteicas y no proteicas con el grupo –CO-NH‒.
Al determinar los aminoácidos cíclicos, se usa una reacción de xantoproteína con una solución concentrada de ácido nítrico HNO3 , que da un color amarillo cuando se nitra. Una gota de reactivo sobre la piel también exhibe un color amarillo al reaccionar con los aminoácidos en las células de la piel. El ácido nítrico puede causar quemaduras y también debe manipularse con guantes.
Ejemplos de interacción con compuestos amino
La reacción de la ninhidrina para los α-aminoácidos da un buen resultado visual, a excepción de las estructuras de color prolina e hidroxiprolina, que reaccionan con la formación de un color amarillo. Una posible explicación para este efecto se encontró en otras condiciones ambientales de la interacción de la ninhidrina con estas estructuras.
Reacción con grupo amino
Dado que la prueba no es específica, no es posible la detección visual de alanina utilizando la reacción de ninhidrina en la mezcla. Sin embargo, por cromatografía en papel, cuando se aplican muestras de varios α-aminoácidos, se rocían con una solución acuosa de ninhidrina y se revelan en un medio especial, se puedecalcular la composición cuantitativa no solo del compuesto reivindicado, sino también de muchos otros.
Esquemáticamente, la interacción de alanina con ninhidrina sigue el mismo principio. Se une al reactivo en el grupo amina y, bajo la acción de los iones hidronio activos (H3O+) se separa en el carbono -enlace de nitrógeno, que se descompone en acetaldehído (CH3COH) y dióxido de carbono (CO2). Otra molécula de ninhidrina se une al nitrógeno, desplazando las moléculas de agua y se forma una estructura colorante (Fig. 4).
Reacción con un compuesto amino heterocíclico
La reacción de la ninhidrina con la prolina es específica, especialmente en los análisis cromatográficos, ya que tales estructuras en un medio ácido primero se vuelven amarillas y luego se vuelven moradas en medio neutro. Los investigadores explican esto por una característica del reordenamiento del ciclo en el compuesto intermedio, que se ve afectado precisamente por la presencia de una gran cantidad de protones de hidrógeno que complementan el nivel de energía externa del nitrógeno.
La destrucción del heterociclo no ocurre, y se le une otra molécula de ninhidrina en el cuarto átomo de carbono. Al calentar más, la estructura resultante en un medio neutro se convierte en púrpura de Rueman (Fig. 5).
Preparación del reactivo principal
La prueba de ninhidrina se lleva a cabo con diferentes soluciones, dependiendo de la disolución de las estructuras amino en ciertos compuestos orgánicos ycompuestos inorgánicos.
El principal reactivo es la preparación de una solución al 0,2% en agua. Esta es una mezcla versátil, ya que la mayoría de los compuestos se disuelven bien en H2O. Para obtener un reactivo recién preparado, se diluye una muestra de 0,2 g de ninhidrina químicamente pura en 100 ml de agua.
Cabe señalar que para algunas soluciones analizadas esta concentración es insuficiente, por lo que se pueden preparar soluciones al 1% o al 2%. Esto es típico de los extractos de materias primas medicinales, ya que contienen varias clases de compuestos amino.
Al realizar estudios cromatográficos, las soluciones, por ejemplo, al lavar una mezcla en un soporte sólido a través de una columna, se pueden preparar en alcohol, dimetilsulfóxido, acetona y otros solventes polares; todo dependerá del solvente de ciertos estructuras amino.
Solicitud
La reacción de la ninhidrina permite detectar muchos compuestos amino en solución, lo que la convirtió en una de las primeras en utilizarse en el análisis cualitativo de sustancias orgánicas. La determinación visual reduce significativamente el número de experimentos, especialmente cuando se analizan plantas, medicamentos y formas de dosificación poco estudiados, así como soluciones y mezclas desconocidas.
En ciencia forense, este método es ampliamente utilizado para determinar la presencia de marcas de sudor en cualquier superficie.
Incluso a pesar de la inespecificidad de la reacción, la retirada de la reacción de la ninhidrina de la práctica química es imposible, ya queel reemplazo de esta sustancia con análogos menos tóxicos (por ejemplo, oxolina) demostró que tienen una menor sensibilidad a los grupos amino y no dan buenos resultados en los análisis fotométricos.
